熒光定量PCR檢測儀，是指通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時監測反應過程的儀器。結合相應的軟件可以對產物進行定性和定量分析，計算待測樣品模板的初始濃度。在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程。

熒光定量PCR儀適用于基于能夠在PCR產物生成過程中對產物進行標記熒光的反應，例如TaqMan、分子信標、SYBR Green、MGB等熒光化學體系。

1、樣品到達域值水平所經歷的循環數稱為Ct值（限制點的循環數）。

2、域值應設定在使指數期的擴增效率為最大，這樣可以獲得最準確，可重復性的數據。

3、如果同時擴增的還有標有相應濃度的標準品，線性回歸分析將產生一條標準曲線，可以用來計算未知樣品的濃度。

7500 Fast型實時PCR系統，可在最短的時間內為從事不同應用的實驗室提供最佳的實驗性能，同時還可以進行高分辨率熔解曲線（High Resolution Melting，HRM）分析。

1.開始運行儀器

打開電腦，打開定量PCR儀底座開關啟動CFX Manager軟件。

2.放置樣品

將PCR反應體系加入到0.2ml低緣八聯管，蓋上管蓋；或加入低緣96孔板，用光學級封膜封好。注意，必須帶一次性塑料手套，不要讓手指接觸到反應管表面。將反應管按順序放入儀器的加熱孔中。

3.設置程序，運行實驗

定量PCR軟件操作基本步驟為：

a.設置熱循環程序文件（Protocol Tab），點擊Edit（編輯）或Create New（創建新程序）。

b.設置反應板文件（Plate Tab），選擇本次實驗所要使用的熒光染料種類；單擊樣品類型；如要某些反應孔第一熒光染料對應的樣品類型為標準品（Standard），點擊“Dilution Series”鍵可設置其標準品濃度及稀釋倍數。。

c.點擊“Start Run”鍵，單擊open lid（打開熱蓋）或Close lid（關閉熱蓋）放置樣品；單擊Start Run，保存文件，開始運行程序。

4.結果分析

PCR反應結束后，軟件會自動計算標準曲線和Ct值等。如需進行表達量分析、等位基因分析等，在軟件窗口選擇相應分析功能。點擊右上方的“Report”鍵，還可輸出結果報告單。

5.關閉運行儀器

實驗結束后取出反應管，順序關閉CFX Manager軟件、定量PCR儀電源，關閉電腦。

1、實驗室注意分區：試劑準備間，樣本處理間，PCR室，電泳間要有明確區分，各房間實驗室的實驗服不得混用。

2、試劑準備間及樣本處理間不處理實驗相關的高濃度的核酸模板（如高濃度的標準品，PCR產物，miRNA的minics等）。

3、減少頻繁多次的走動，尤其去過電泳間之后當天不可進入其他房間。

4、使用生物安全柜加樣，不同位置的移液器不可混用，不要隨意更換其位置。

5、在檢測體系中添加UNG酶系統用于避免PCR產物的污染。